PVDF膜
刚开始做WB的人也许会有这种疑问:为什么实验室的老师(或者师兄师姐们)在教我们做WB的时候,如果是用PVDF膜做,总是小心翼翼的剪,节省着用,甚至一些边边角角也舍不得丢掉呢?其实,这不仅是因为PVDF膜比较贵,还由于PVDF膜是做WB的“*”。
聚偏二氟乙烯(PVDF)膜作为基质的转印膜由Millipore公司在1985年首先推出。与硝酸纤维素膜相比,PVDF膜在蛋白质截留能力,机械强度和化学相容性上都更*的性能(Pluskal,et al.,1986)。市售硝酸纤维素膜的典型结合量是80-100μg/cm2,而PVDF膜结合量是100-200μg/cm2(而结合强度PVDF比硝纤膜强6倍!)。在艾滋病毒(HIV)血清学检验中直接比较PVDF和硝酸纤维素膜,PVDF膜具有更好的截留总HIV抗原能力并提高抗体检测糖基化被膜抗原的性能。但是PVDF膜zui大的优点不仅于此:更好的机械强度和化学耐受性使PVDF膜在各种染色应用和多重免疫检测中成为理想选择;而且单个凝胶的泳道复本可用于多种目的,如考马斯亮蓝染色后切出条带并进行N-末端测序、蛋白消化/肽分离/内部测序和免疫检测(Kurien,et al.,2003)。特别是需要做N端蛋白测序,在相当“严酷”的清洗条件下,当尼龙或者硝纤膜已经降解的情况下PVDF膜依然保持本色,笑傲江湖。所以PVDF也是要做蛋白测序的*选择。此外,个人经验,一些强疏水蛋白用PVDF膜效果会更好一些。PVDF膜适用的检测方法也不少,化学发光、常规显色、同位素和标准染色都一样OK,但不适合荧光。PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理(不超过15秒)再用缓冲液平衡,才能用,而且适用过程中万一干了也要同样程序再处理(不过要真出现这种问题也是自己欠扁,谁要你不小心呢,转膜前处理也就罢了,转膜后再这样处理可能会影响后继的抗体识别呢)。PVDF膜同样分0.45um和0.2um的,后者孔径小,对小分子蛋白有较好的拦截吸附,背景可能会比前者稍高。
PVDF膜常见的有以下几个品牌
公司 | 产品名 | 孔径 | 适用范围 | 参考价格 |
Millipore | Immobilon Transfer Membranes | 0.45um 0.2um |
| 2050.00 |
Bio-Rad | Immun-Blot PVDF Membrane |
| Chemiluminescent, colorimetric western blots, amino-terminal sequence and total amino acid composition |
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Pierce | PVDF Membrane | 0.45um 0.2um | Western, Southern, Northern, and dot blots |
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Pall Life Science | BioTrace PVDF Transfer Membrane | 0.45um | Nucleic acid and protein transfers. Protein sequencing | 2200.00 |
Invitrogen | PVDF Membrane | 0.45um | Protein sequencing, immunoblotting |
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Whatman | Westran Clear Signal PVDF Membrane | 0.45um | Western blots |
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作为PVDF膜的鼻祖,Millipore公司的PVDF膜Immobilon系列分为Immobilon-P(0.45um), -PSQ(0.2um), -FL(用于荧光显色)和Blotting Sandwiches for High Troughput四种。Immobilon-P膜孔径均一,具有*的吸附能力,染色性能好、抗溶剂能力强和信噪比高,有助于提高检测灵敏度,而且开放的孔结构容易接近被吸附的蛋白质,并有助于去除背景上没有吸附的探针,可以说是免疫印迹检测理想的印迹膜。Immobilon-PSQ转印膜是印迹小分子蛋白质(<20KDa)的理想选择——优良的蛋白质吸附性能,渗漏少。内表面面积较大,可供蛋白质吸附从而提高蛋白质测序的得率。由于不含污染性支撑物或表面活性剂,Immobilon-PSQ层析谱上的背景峰值极小。Immobilon-FL也是Millipore值得骄傲的产品,因为这是*个专门为荧光显色优化的转移膜。通过实验证明,这种膜在Kodak成像系统可以显示仅7ng的蛋白,听起来不错吧,有兴趣可以试一试。这几种膜除了一般的PVDF膜的优点之外,zui大特点就是一个字——快。按照Millipore的操作手册,Immobilon可以在保证质量的前提下缩短WB时间到2个小时——主要是缩短封闭和洗脱时间。这可真是个好消息,因为坐在那儿等WB结果多浪费时间啊!缩短这个费时而枯燥的过程,早出结果,可以提高实验效率,利于我们分析实验结果,考虑下步对策嘛。卷膜经济实惠,裁剪剩下的边角料还可以用来做点杂交,而预裁剪的即用膜更适合高通量等等“用金钱换时间”的实验。再次强调的是,疏水PVDF膜在用前必须经过50%或以上体积比的甲醇或者乙醇溶液处理几分钟,待膜变成半透明后用MilliQ水或者纯水漂洗一下,转入电泳缓冲液平衡才能用。